黄曲霉毒素
黄曲霉毒素（ Aflatoxin，AF）是黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，广泛存在于各类变质食物中，其性质稳定、毒性高、易致癌，可导致家畜和人类患病，严重危害动物和消费者健康。准确、快速的 AF 检测方法对保障食品安全，保护消费者安全至关重要。本文将简介常见的 AF 检测方法，并介绍酶标仪检测法的实际案例及其特点优势。
1960 年，英国发现有 10 万只火鸡死于一种以前没见过的病，被称为“火鸡 X 病”，追根溯源，最大的嫌疑是饲料。这些火鸡和鸭子吃的是花生饼。这些花生饼被一种来自真菌的有毒物质污染，经过进一步研究和确认后，人们发现了是黄曲霉( Aspergillus.flavus )产生的有毒代谢物质，黄曲霉毒素( Aflatoxins )。
从化学结构上看，黄曲霉毒素是高度取代的香豆素。黄曲霉毒素在长波紫外光下产生荧光，根据荧光颜色、RF值及结构不同等分别命名为 B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，R1，GM 和毒醇。其中以 B1 的产量最高，毒性最大，致癌性最强， G1 和 M1 的毒性次之。
图 1 .部分黄曲霉毒素的结构
极强的致癌物
黄曲霉毒素广泛存在于自然界中，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。
黄曲霉毒素对人类健康的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物，包括受黄曲霉毒素(主要为 B1 )污染的植物性食物摄入，以及经饲料而进入奶或乳制品(包括乳酪、奶粉等)的黄曲霉毒素(主要为 M1 )。黄曲霉毒素 B1 的半数致死量为 0.36 mg/kg 体重，属特剧毒的毒物范围，它引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎、肝硬化、肝坏死等。临床表现有胃部不适、食欲减退、恶心、呕吐、腹胀及肝区触痛等；严重者出现水肿，昏迷，以致抽搐而死。
2017 年 10 月 27 日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，黄曲霉毒素在一类致癌物清单中。
鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性，全世界各国都针对黄曲霉毒素检测出台了相应的标准，目前国际上对各种食品、农产品、饲料中黄曲霉毒素含量的检测已成为强制的措施；近年来，随着科学技术的不断发展，黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用：
薄层层析法（ TLC ）是测定黄曲霉毒素的经典方法，其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长 365nm 紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。其不足之处在于传统 TLC 的样品前处理繁琐，实验过程较复杂，耗时长，且受样品提取、 纯化、展开、分离等多种因素的影响，精确性较差，安全性欠佳，因此逐渐被其他检测方法所取代。
高效液相色谱法（ HPLC ）近几年发展起来的检测 AFB1 的方法，其原理是样品溶液中欲分离的几种化合物在流动相和固定相之间有不同的分配量，从而达到分离的目的。黄曲霉毒素经柱后电化学衍生化后，能发射特征性荧光，被荧光检测器捕获后而得到检测，最后经化学工作站处理数据。该方法具有高效快速、定量准确、灵敏度高、检测限低等优点，是目前测定黄曲霉毒素比较权威的方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备，需要专门的技术人员操作，难以满足现场化的要求。
微柱筛选法的原理是样品提取液通过由硅镁吸附剂和氧化铝组成的微柱层析管后，黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附，杂质被氧化铝吸附。在紫外灯下观察结果，将层析后的样品管依次与 0 、5 和 10ng 的 AFB1 标准管比较。如果样品管内硅镁吸附剂层与 0ng 标准管一致，则为阴性( 5μg/kg 以下)，如果呈现蓝紫色荧光，则为阳性。此方法优势在于微柱筛选法设备简单、操作简便。不足之处在于微柱不能分离 B1、B2 、G1 和 G2 。所以，该方法只能检测黄曲霉毒素的总量，是一种适用于样品快速筛查的定性检测方法。
免疫法是以抗原抗体的免疫化学反应为基础进行抗原抗体含量测定的方法，为利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设的黄曲霉毒素的免疫分析方法。目前也是最常用的黄曲霉毒素检测方法，该类方法具有高度特异性、灵敏性、快速简便、分析费用低、重复型好、短时间内处理大量样品和易于普及等优点。这类方法主要包括放射免疫分析方法，免疫层析法、荧光光度法(免疫层析柱净化—荧光光度法)及酶联免疫法。它们均可以对黄曲霉毒素进行定性和定量测定。
在免疫法中，酶联免疫吸附法（ ELISA ）是一种常见的、成本相对较低的食品和饲料样品中霉菌毒素检测方法，利用抗原-抗体反应的高特异性和酶促反应的高敏感性实现对抗原或抗体的检测。ELISA 有直接竞争和间接竞争两种模式，可用酶标仪进行结果判读，通量高，极大地节约时间和成本。
下面以检测大麻中黄曲霉毒素的水平为例，阐述ELISA 试剂盒与酶标仪的联用。
图 2 . 大麻样品的处理和 ELISA 工作流程
优点
节约时间和成本，高通量、低成本的 ELISA 方法
在单个提取物中分析多种黄曲霉毒素
使用 SoftMax Pro 软件可以快速评估结果
材料
AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA 试剂盒 ( Romer Labs cat. #10002098 )
AflaStar R Rapid Clean-Up IAC 柱子 ( Romer Labs cat. #10001963 )
Aflatoxin B1 Standard 标准品 ( Sigma cat. #34029 )
Cannabis flower 大麻的花卉 ( 加州药房获取 )
Methanol, HPLC grade 甲醇，HPLC级 (Sigma cat. #34860)
Ammonium acetate 醋酸铵 ( Sigma cat. # 73594 )
SpectraMax ABS Plus 酶标仪 ( Molecular Devices )
SpectraMax iD5 多功能酶标仪 ( Molecular Devices )
制备样品
将大麻样本放在一个塑料袋里，用手压碎。称量 1 克样本并将其放入 4 个 50mL 的锥形管中。然后在样本中分别添加 0、10、20 和 30 ppb 黄曲霉毒素 B1 标准品。再加入 20mL 70% 甲醇至样本中，剧烈涡旋 3 分钟。所得提取物通过 Whatman 1 级滤纸过滤到干净的 50mL 锥形管中。
在每一个提取、过滤得到的样品中，吸取 4mL 至干净的锥形管中，并加入 20 mL 去离子水。总的 24mL 溶液通过免疫亲和层析柱( IAC )纯化。样品中的黄曲霉毒素与层析柱中的抗体选择性结合。用 20mL 0.5M 醋酸铵冲洗柱子，将未结合的物质冲洗掉。最后用 1mL 100% 甲醇洗脱样品，收集于干净的试管中。
黄曲霉毒素 ELISA 检测方法
每个标准品和待测样品的稀释孔做三个重复，放置于微孔板条固定器中。将等量抗体包被的微孔放置在单独的板条固定器（ ELISA 板）中。未使用的微孔放回带有干燥剂的铝箔袋中。
每个稀释孔加入 100uL 的偶联物，然后加入 50uL 黄曲霉毒素标准品或待测样品。根据试剂盒方案，偶联物与样品保持 2 ：1 的比例。孔内溶液用 8 通道移液器混合均匀。每种稀释溶液取 100uL 转移到 ELISA 板的抗体包被过的微孔中，室温孵育 15 分钟。
孵育后，用去离子水清洗 ELISA 板 5 次。向板中加入 100uL 底物，室温孵育 5 分钟。加入 100uL 终止液，用 SpectraMax ABS Plus 和 SpectraMax iD5 酶标仪测量样品在 450nm 波长下的吸光度。
结果
用 SoftMax Pro 软件绘制黄曲霉毒素标准曲线，由 4、10、20 和 40 ppb 标准品组成（图 2 和图 3 ）。软件计算每个标准品的结合百分比（ %B/B0 ）。B 是每个标准品的平均吸光度值( OD )， B0 是 0 ppb 标准品的平均吸光度值。不含抗原的孔（ B0 ）吸光度值最大。
使用 SoftMax Pro 软件中的公式编辑器和分组表格计算 %B/B0 值和 Log (B/B0) 值。这些分析方法建立好后，保存为软件中的模板，便于在将来的实验中自动化分析数据结果。
待测样本中黄曲霉毒素的百分回收率通过标准曲线测得。10、20、30ppb 的三个待测样本测得回收率在 71% 至 112% ，符合推荐的标准（表 1 ）。
表 1 . 添加了标准品的回收率。在添加了黄曲霉毒素 B1 的样品中，黄曲霉毒素 ELISA 的百分回收率在可接受 的限度内。
图 3. 在 SoftMax Pro 软件中绘制黄曲霉毒素标准曲线。将 4、10、20、40ppb 的黄曲霉毒素标准品绘制为 Log(B/B0)vs.Log(Concentration) 的曲线。R^2=0.997 。标准曲线的数据由 SpectraMax ABS Plus 酶标仪测得。
图 4 .黄曲霉毒素标准品曲线，标准品在 4、10、20、40ppb 的 Log(B/B0) vs. Log(Concentration) 。R^2=0.998。标准曲线的数据由 SpectraMax iD5 多功能酶标仪测得。
由以上实验可见，酶联免疫吸附试验易于使用，灵敏度高，可以处理大量的测试样品， Total Aflatoxin 4/40 ELISA 试剂盒能够定量黄曲霉毒素的水平，以确保食品和饲料产品的安全。
Tips 黄曲霉毒素污染的预防措施●●
通过正规可靠渠道购买食物
不要购买包装不洁、破损、发霉的食物，注意产品的标签、标识。
合理存放食物
把食物存放在阴凉干燥的地方，尽快食用，不要食用过期及霉变食品，及时丢弃霉变或破损的食品。
远离变质食物
远离剩饭剩菜，不吃发苦的坚果