补体系统是先天免疫中的重要机制，提供了对微生物感染的强大防御。补体系统失调时会引起多种肾相关疾病，包括狼疮性肾炎、
C3肾小球肾炎、非典型溶血性尿毒综合症（aHUS）、阵发性夜间血红蛋白尿症（PNH）。其中aHUS和PNH为罕见的血液疾病，具有
生命危险，目前临床上主要使用依库珠单抗(Eculizumab)治疗。
孤儿药Eculizumab为一类末端补体抑制剂，是一种靶向补体C5的人源化单克隆抗体。Eculizumab阻断孔膜攻击复合物（MAC）
的形成，能够稳定血红蛋白水平，降低血小板减少、血栓形成和急性肾功能衰竭的风险。但是Eculizumab非常昂贵并且每隔一至两周
就要给药一次，对于C5的变异体p.Arg885His没有好的疗效，带给患者及其家属诸多不便。因此，开发新的药物且延长药物的半衰期
对于补体介导的临床治疗十分重要。
再循环抗体（recycling antibody）可以在胞外结合抗原，在细胞内与抗原解离，由FcRn将抗体释放回到血液中，使抗体结合抗
原次数最大化，减少抗原介导的抗体清除效应和抗体介导的抗原累积效应。研究人员研发得到一种新的靶向C5的人源化抗体SKY59，
以pH依赖的方式与C5发生相互作用，抗体Fc段与FcRn结合后的循环作用有助于延长其在血液中的留存时间，使抗体药物具有更长的
半衰期。
研究人员首先使用人源C5蛋白免疫兔子，产生了一系列的C5抗体。使用Biacore筛选出具有pH依赖性抗原结合的抗体，即在
pH7.4的亲和力强于pH5.8。对得到的抗体CFA0305进行人源化改造、pH依赖的亲和力优化以及Fc受体结合能力改进（图1），最终得
到人源化抗体SKY59。从Biacore结果可以看到，CFA0305抗体与改造后的SKY59抗体与C5的结合活性均具有不同程度的pH依赖性
（图1 实线=pH 7.4，虚线=pH 5.8）
图1 SKY59 抗体设计及使用Biacore验证抗体结合C5的pH依赖性
随后研究人员使用Biacore T200将ProA/G偶联在C1芯片上，在37℃下分别捕获CFA0305和SKY59抗体，人源与猴源的C5蛋白
作为分析物，检测在不同的pH条件下的亲和力与动力学。如表1所示，改造后的人源化抗体SKY59与C5的亲和力均高于CFA0305。并
且SKY59抗体与人源C5在pH7.4的亲和力为1.52 ×10−10 M，在pH 5.8的亲和力为1.68 ×10−7 M，两者在pH7.4中的亲和力比在pH
5.8中的亲和力高1105倍，定量数据再次验证了抗体SKY59以pH依赖的方式与C5结合。除此之外SKY59与FcRn的亲和力高于常见的抗
体药物曲妥珠单抗(Trastuzumab) ，预测SKY59在体内有更长的半衰期(表1)。
表1 SKY59与人源和猴源C5蛋白以及FcRn的亲和力
为了进一步确认SKY59和C5之间作用的关键位点。研究人员首先通过Western blot分析得知SKY59与C5上的MG1结构域（20–
124）结合，X射线晶体结构也显示MG1结构域的三个氨基酸E48、D51和K109有可能影响与SKY59的结合（图2）。为了确认这一结
果，研究人员用丙氨酸取代 E48、D51和K109，得到三个新的C5突变体。使用Biacore 将ProA/G偶联在CM4芯片上，在37℃下分别
捕获SKY59抗体，依次流过3个C5蛋白的突变株上清液(4μg/ml) ，结果显示突变后的C5蛋白与SKY59抗体的结合能力急剧下降，证明
MG1结构域的三个氨基酸E48、D51和K109确实是SKY59和C5结合的关键位点（图3a）。同时从Eculizumab与三个C5突变体的互
作结果可以发现结合能力没有明显差异(图3b)，说明SKY59与Eculizumab结合于C5的不同表位。
图2 C5蛋白MG1结构域
(a) SKY59
(b) Eculizumab
图3 Biacore检测(a)SKY59和(b)Eculizumab与C5突变体之间的亲和力差异
X射线晶体结构还显示人源C5上的三个组氨酸残基H70, H72,H110也参与到了和SKY59的相互作用中。研究人员假设这几个组氨
酸残基与SKY59抗体pH依赖性地结合C5有关，在Biacore上设计实验验证这一猜想。SKY59抗体结合不同的C5蛋白组氨酸突变体形成
的复合物在pH 7.4解离一段时间后，用pH 5.8的缓冲液继续解离（图4a），比较各突变体和野生型C5在pH 5.8中解离速率的差异（图
4b）。结果显示在pH 5.8时，H70Y结离速率比WT慢3倍，而H70Y+H110Y双突变的C5解离速率更慢，几乎是C5野生型的5倍，这证
实了C5蛋白70位和110位的组氨酸与pH依赖性抗原结合密切相关。将C5中72位的组氨酸突变后得到的H72Y突变体失去了结合SKY59
抗体的能力，表明这一组氨酸对于C5结合SKY5抗体是必须的(图4a)。
图4 Biacore检测SKY59与C5组氨酸突变体的相互作用
最后研究人员通过一系列动物实验证明这种新型的再循环抗体SKY59具有更长的半衰期，在猕猴中单次给药（20mg/kg）即可在
长达两个月的时间内抑制补体活性。SKY59抗体这种pH依赖性的抗原结合方式，在抗原抗体复合物被内化进细胞后，在内涵体酸性的
环境下，再循环抗体与抗原解离，解离抗原后的抗体被FcRn捕获循环到胞外，在胞外中性的环境下，FcRn将抗体释放，回到血浆中的
SKY59抗体可以再结合C5，实现抗体的循环使用，可以降低患者的给药频率，为补体相关疾病患者与家属带来更多的安全性与便利
性。
回顾整篇文章，研究人员采用Biacore在分子水平上证实了再循环抗体SKY59与靶点C5结合的pH依赖性，相互作用机制与表位分
析。并且结合动物实验证明这一抗体药能延长其药效，对于补体系统失调所引起的疾病是一个有潜力的临床治疗手段（图5）。
图5 文章整体思路梳理
Biacore作为分子互作的金标准在整个研究中提供了大量核心数据，也体现了强大的优势：Biacore可以对分析温度和样品舱温度
独立设置4-45℃的精确控温，可以轻松实现在本研究中37℃生理温度下的互作检测。作为主角的再循环抗体SKY59具有pH依赖性结合
C5的特性，因此实验中需要频繁切换不同pH的缓冲液进行实验，Biacore的buffer selector可以切换四种缓冲液入口实现pH 7.4和
pH 5.8不同条件的自动转换。此外Biacore实验中不仅可以使用纯化的C5蛋白作为分析物，也可以直接取细胞上清进行检测，实现对
粗样品的直接检测。相信有了Biacore助力，未来一定会有越来越多的抗体药物从研发走向上市，构建人类健康未来。
文章来源：Cytiva思拓凡公众号