新冠疫苗接种后的免疫反应研究全讲解


简 介


新冠病毒的出现导致了世界范围内的新冠大流行,为了理解病毒的发病机理并开发疫苗,亟需快速开发多种研究工具。检测病毒感染和

疫苗接种后的免疫反应对新冠病毒的研究十分重要。由于中和抗体是免疫反应和疫苗效价的关键生物标志物,患者血清样本中的中和性抗体

水平是用于监测有效性的重要参数。


人体血清中和抗体的鉴定常使用传统方法例如蚀斑减少中和试验 ( PRNT ) 来检测。然而,该方法使用活的、具备感染性的病毒加入到靶

细胞中,所以需要生物安全三级实验室以及耗时费力的细胞培养。数据结果的分析耗费时间并且不能自动化。此外,假病毒中和试验 ( pVNT

 ) 方法使用改良型的病毒,可以在生物安全二级实验室完成,但此方法需要细胞培养和荧光成像来测得中和抗体活性,因此,也不适用于样

品的高通量筛选。


 GeneScript cPass 新冠病毒中和抗体检测试剂盒采用免病毒中和测试法 (sVNT) 来克服传统的病毒中和实验的缺点。它采用酶联免

疫吸附试验 (ELISA) 的模式,如图 1 和图 2 所示。


 优 势 

  • 快速、简单的 ELISA 实验流程设置。

  • 无需三级实验室或细胞培养。 

  • 实验结果与蚀斑减少中和试验数据一致。


刺突蛋白受体结合区域的 HRP 偶联片段与含有中和性抗体的患者血清样本相结合。此混合物加入到已被 ACE2 受体包被的 ELISA 孔板

中。如果样品中的抗体有中和抗体的活性,那么 HRP-RBD 同 ACE2 的结合将会被打破,随后清洗,移除 HRP-RBD 。使用光吸收微孔板读

板机测量产生的信号,在中和抗体存在的情况下,此信号会更低,将此信号与实验对照组的信号进行比较,可以评估待测样本中存在的中和

抗体活性。


在此,替代的病毒中和实验 ( sVNT ) 试剂盒的数据结果,由 SpectraMax 微孔板读板机进行检测、 SoftMax Pro 软件进行分析得到。这

些结果与先前使用的传统假病毒中和试验( pVNT ) 方法得到的结果密切相关,然而只需要一小部分地时间和更低的生物实验室安全等级限

制。


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          图 1 对比 PRNT 和 sVNT 试剂盒的操作流程。sVNT 实验方法能在二级实验室中 1 小时内完成,而 PRNT 需要活的新冠病毒以及繁琐的细胞培养技术,

                                                                                                        在三级实验室中也要两天多的时间。


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                            图 2 新冠病毒 sVNT 检测方法。此实验使用 ELISA 模式,在待测样本中通过中和性的抗体能够检测 RBD 与 ACE2 结合的扰动。


材 料


  • GenScript cPass 新冠病毒中和抗体检测试剂盒 ( GenScript cat. #L00847-A ),

  • 10 份血清样本,已经通过 PRNT ( Corgenix ) 方法证实中和抗体阳性,

  • 3 份血清样本,已经通过 PRNT ( Corgenix ) 方法证实中和抗体阴性,

  • MultiWash+ 微孔板洗板机( Molecular Devices )

  • 光吸收检测模式用到的 Molecular Devices 酶标仪:

  • SpectraMax ABS Plus 酶标仪

  • SpectraMax iD5 多功能酶标仪

  • SpectraMax i3x 多功能酶标仪

  • SpectraMax M5e 多功能酶标仪


方 法


在实验开始前,试剂盒的所有组分和待测样本可放置于室温。试剂盒中的试剂需要按如下操作稀释:

  • 用去离子水稀释 20x 储液得到 1x wash,

  • 用 HRP 稀释缓冲液按 1:1000 比例稀释 HRP-RBD 储液得到 HRP-RBD 工作液。


待测样本和实验对照组分别与 HRP 偶联的 RBD 混合,并按如下操作孵育。待测样本、阳性对照、阴性对照,分别用样品稀释缓冲液按

 1:10 比例稀释,例如:12uL 待测样品+ 108uL 缓冲液。将稀释后的样品和对照组分别与等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的试管中,例

如:120uL HRP-RBD 工作液+ 120uL 稀释后的待测样品或对照品。此混合物在 37 度孵育 15 分钟。


分别添加 100uL 的阳性对照混合物、阴性对照混合物、待测样品混合物至实验复孔中。然后封盖,在 37 度孵育 15 分钟。


使用 MultiWash+ 洗板机和 1x wash 溶液清洗所有的微孔板,每次每孔 300 uL,横向吸液。然后,100uL TMB 溶液加入到每个孔中,封

盖,避光,室温孵育 15 分钟。


使用 MultiWash+ 洗板机和 1x wash 溶液清洗所有的微孔板,每次每孔 300 uL,横向吸液。然后,100uL TMB 溶液加入到每个孔中,封

盖,避光,室温孵育 15 分钟。


与 TMB 底物孵育后,50 uL 终止溶液加入到每个孔中,立即在多款酶标仪上测读,光吸收波长设置为 450 nm。


实验结果的有效性评估看阴性对照的 OD450 值是否大于 1.0,阳性对照的值是否小于 0.3。如果不符合这些标准,实验结果无效,需要

重复试验。


各个待测样本的百分比抑制值按如下公式计算:

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表 1 的卡值被用来说明样本的结果是阳性还是阴性,是否存在可检测到的新冠中和抗体。表中的卡值来源于新冠 sVNT 试剂盒手册。对

于不同地区和种族背景,使用者可以直接基于具有代表性的患者血清样本设置卡值。

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                                                                                        表 1 抑制性卡值大小用于说明实验结果。

 

结 果


使用阳性和阴性对照评估实验结果的质量。如表 2 所示,阴性对照的 OD450 值大于 1.0,阳性对照的  OD450 值小于 0.3,这是根据

 sVNT 试剂盒的质量控制要求而定。

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             表 2,阴性对照的 OD450 值大于 1.0,阳性对照的 OD450 值小于 0.3,验证了实验结果。对照组做一次重复实验,变异系数 CV 值小于 30% 是可重现的。


如方法中所描述,待测样本和阴性对照的 OD450 值用于计算百分比抑制值。基于试剂盒手册中一般的卡值特点,百分比抑制值大于等于

 30% 说明检测到新冠中和抗体,呈阳性;百分比抑制值小于 30% 说明未检测到新冠中和抗体,呈阴性。在 PRNT 中和活性检测中呈阴性的

三个样品,在 sVNT 检测中也呈阴性。同样地,在 PRNT 中和活性检测中呈阳性的十个样品,在 sVNT 检测中也呈阳性 ( 如表 3 )。

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         表 3 先前测得的多个样品的百分比抑制值和阳性、阴性结果。使用 SpectraMax ABS Plus 获得表中所示的实验结果,其他类型的酶标仪也获得相同的结果。


 结 论 

此 GenScript cPass 新冠病毒中和抗体检测试剂盒数据来源于一组患者血清样本,与传统的、耗时费力的 PRNT 方法获得的数据吻合。

此 sVNT 试剂盒提供了易于使用的试剂和紧凑的 ELISA 工作流程,大约 1 小时能够完成。其中必需的一步清洗操作由 MultiWash+ 洗板机完

成,节约了宝贵的时间。SpectraMax 读板机和 SoftMax Pro 软件产生的数据能够运用实验特异的方案进行分析,设置公式可以应用于所需的

计算和自动结果输出。


参考文献:

1. Lau EHY, Tsang OTY, Hui DSC, Kwan MYW, Chan W, Chiu SS, Ko RLW, Chan KH, Cheng SMS, Perera RAPM, Cowling BJ,Poon LLM, and Peiris M. Neutralizing antibody

 titres in SARS-CoV-2 infections. Nature Communications 12:63 (2021).

2. Sahin U, Muik A […] and Tureci O. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and TH1 T cell responses.Nature 586, 594–599 (2020).

3. SARS-CoV-2 surrogate Virus Neutralization Test (sVNT) Kit Manual (cat. #L00847).


文章来源:美谷分子仪器公众号

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