关于Western Blot 的“前世今生”

蛋白质印迹( Western Blot ，简称 WB )是一种常用的蛋白检测和定量的技术，它可以从复杂的蛋白混合物（例如细胞裂解物）中分离和检测某种特定的目标蛋白。蛋白印迹法可应用于诊断、生物技术、分子生物学、蛋白质组学等，且在评估细胞中的蛋白表达水平以及大小和其他属性的变化时均广泛依赖于这种方法。

这项实验技术对于生物相关专业的本科生或研究生来说，已是如家常便饭一样令人熟知，有不少老师和同学体都验过为了这个实验而经历的那些酸甜苦辣。但是不管怎样，正是因为它的出现，才让我们在蛋白检测方面拥有了更加有力的手段。而关于 WB 诞生的历史，也是一个有趣的故事：在 1979 年，西方国家有三个独立的科学家团队致力于蛋白免疫印迹 ( Protein Immunoblot ) 方法的建立，这三个团队的领头科学家分别是 Neal Burnette 、 Harry Towbin 和 George Stark 。当时， George Stark  团队在 1979  年 7 月发表了以碘 125 标记的蛋白 A 用放射自显影法检测特异性蛋白的方法；Harry Towbin  团队则应用现在众所周知的蛋白电泳转移原理，成功将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素介质，并于 1979  年 9 月发表；尽管 Burnette  团队其研究结果被编辑拒稿，但他却首次将蛋白印迹技术称之为 Western Blot ，这一别具“创意”的名字跟同样被大家熟知的以 Southern Blot 命名的 DNA 杂交检测技术和以 Northern Blot 命名的 RNA 杂交检测技术一起沿用至今。

WB 的主要工作原理是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式按照分子量大小来分离蛋白质，经过凝胶分离的蛋白质样品转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，用对应的第一抗体结合蛋白质，再用酶标记的第二抗体结合第一抗体，通过底物显色以检测电泳分离的特异性目的蛋白成分，该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。它的主要步骤概括起来分为：1 .收集和准备蛋白样品；2 .电泳；3 .转膜；4 .封闭；5 .一抗孵育；6 .二抗孵育；7 .蛋白检测。以下流程图也展示了传统 WB 的基本工作流程：

然而，沿用至今的 WB 技术也有其局限性，需要不断提高其定量的准确性和动态范围。在这里，我们着重介绍一种新的 WB 膜蛋白分析系统 ScanLater Western Blot ，该系统可以整合到 Molecular Devices 公司 SpectraMax 多功能微孔板读板机中。用铕螯合物标记的二抗孵育膜，这些二抗特异性结合针对感兴趣蛋白的一抗。这些膜被放置在一个微孔板读板机系统中，在那里它们通过优化的时间分辨荧光功能扫描。此方法不涉及酶检测，而且铕-螯合物对光漂白具有抗性，因此信号在很长一段时间（几周到几个月）内保持稳定。这样就能实现重复检测膜上的蛋白条带，并且不会降低定量的准确性。此外，该系统也不会像化学发光或荧光检测那样出现相机光晕，因此具有锐利的蛋白条带和优秀的图像质量。

Molecular Devices 公司将 WB 检测与微孔板读板机相结合，在这个检测中，主要利用了上面提到的时间分辨荧光( Time-Resolved Fluorescence ，简称 TRF )功能，它是多功能微孔板读板机的主流检测功能之一，通常需要配合镧系元素作为荧光染料来实现时间分辨荧光的检测。说到镧系元素，和普通荧光染料相比，它们较为特殊，均为金属，也均是稀土元素的成员。它们有着普通荧光染料所不具备的长荧光寿命，普通染料的荧光寿命基本都在 ns 级别，而它们却都在 μs 甚至 ms 级别。所以，和普通染料只能激发和检测同时进行的模式不同， TRF 配合镧系元素可以将激发和检测两者分开进行，也就是先激发、然后停止激发、最后延迟检测。整个过程可以用下图概括：

从示意图中我们可以看到在激发光关闭后，短寿命的背景荧光迅速减弱，一小段时间后，当背景荧光几乎消失时再检测镧系元素的荧光信号，此时所获得的信号基本没有背景干扰，使得这一检测功能具有高灵敏度和高信噪比的优势。在所有镧系元素中，通常用作荧光染料的主要有铕( Eu )、钐( Sm )、铽( Tb )、镝( Dy )四种，其中以 Eu 最为常用。这四种镧系元素均为紫外激发且波长一致，只有发射波长不同。

ScanLater Western Blot系统将 Western Blot 和微孔板读板机通过TRF检测功能有机结合在一起，不仅实现了在读板机上进行 WB 条带扫描，而且具有与传统化学发光法相当的检测灵敏度、更高的检测动态范围、更稳定的荧光信号。因为二抗标记的是镧系元素而非酶，所以无需加入底物反应，简化了 WB 实验操作步骤并节省了时间，尤其适合多个膜的批量检测，相信这套系统能够提高您的 WB 实验效率、助力您的蛋白相关研究。