磷酸化（Phosphorylation）或称磷酸化作用，是指将磷酸基团加在蛋白质或其他类型分子上的过程，对蛋白质功能的正常发挥起着重
要的调节作用。蛋白质磷酸化是一个可逆的动态过程，其中添加磷酸基团的酶称为激酶；除去磷酸基团的酶称为磷酸酶。磷酸化作为生命活
动调控关键方式，研究蛋白磷酸化对于疾病的发生发展机制，药物靶点研发等领域都是重中之重，在近些年大热的G蛋白偶联受体
（GPCRs）、合成生物学等研究中也都有磷酸化调控的参与。
图1. 磷酸化和去磷酸化作用过程
在磷酸化蛋白检测中，通常我们除了要测定磷酸化蛋白之外，往往也需要检测总蛋白。而为了确保上样量一致，内参蛋白的检测也必不
可少。
磷酸化蛋白显影 剥离、封闭后显影 重新孵育总蛋白显影
图2.磷酸化蛋白化学发光检测流程
常规的化学发光检测流程中，由于磷酸化对蛋白分子量改变较小，通常我们在印迹膜封闭后首先孵育检测磷酸化蛋白，之后将印迹膜上
结合的抗体剥离、重新封闭、再孵育检测总蛋白。做好WB已经如此艰难，磷酸化WB可谓是难上加难了。Cytiva提供荧光成像解决方案，助您
从传统WB进行无缝切换，轻松完成磷酸化实验。
图3.两种WB检测流程
通过孵育不同种属的一抗，再结合不同通道的荧光二抗即可实现多通道目的蛋白同时检测。再也不用重复的剥离洗脱，一张膜上即可同
时检测磷酸化蛋白、总蛋白以及内参蛋白。荧光WB既节省了操作步骤提高效率，也避免了重复处理印迹膜产生的误差，实现精准高效定量。
图4.三重荧光蛋白检测磷酸化，采用Amersham ImageQuant 800系列拍摄
当然，为了达到更好的实验结果，我们也有一些小Tips给到大家：
提取蛋白过程迅速，样本要新鲜，冰上操作处理
裂解缓冲液中添加磷酸酶抑制剂
推荐使用BSA（牛血清蛋白）替代脱脂奶来进行封闭，也可采用商品化ECL 封闭液
荧光WB中推荐采用NC膜或低荧光背景LF PVDF膜进行实验
好的实验结果离不开优秀的实验设备，Cytiva Amersham ImageQuant 800多功能成像仪可提供红绿蓝（RGB）可见荧光及双色近红
外（NIR）五色荧光检测功能。F0.74 大光圈镜头搭配830W像素 CCD满足磷酸化蛋白检测高灵敏、高分辨的检测需求，更有全新SNOW 模
式带来超高动态范围，强弱信号一网打尽！
文章来源：Cytiva思拓凡微信公众号